2013年，Broad研究所的张峰以及Eric S. Lander两个研究团队，同时于Science中揭晓了CRISPR-Cas9的文库运用，初次把这项技能袒露于了公家视线中。跟着科研软实力以及CRISPR-Cas9系统开放性的不停增长，于2017年后文库筛选已经经成了一种重要的差异基因掘客东西。可是今朝仍旧有许多人不知道文库的详细的试验体式格局及运用场景。

2022年3月25日，Julia Joung等人于Nature Co妹妹unications揭晓 CRISPR activation screen identifies BCL-2 proteins and B3GNT2 as drivers of cancer resistance to T cell-mediated cytotoxicity ，文中借助CRISPR-Cas9文库筛选技能开展肿瘤研究。本文以此为例，阐发CRISPR-Cas9文库的研究思绪。

1 技能思绪

经由过程CRISPR-Cas9激活文库确定恶性玄色素瘤细胞A375中与免疫耐受相干的相干基因，并经由过程MAGeCK与现有转录组数据以及TCGA数据库成果阐发后，确定4个候选基因，为CD27四、MCL一、JUNB、B3GNT2。起首，别离构建CD27四、MCL一、JUNB、B3GNT2 4个基因的过表达细胞株。然后于体外，经由过程CTG法检测NY-ESO-1 CAR-T细胞对于4株过表达细胞及比照细胞的杀伤威力差异。于体内，使用NGS小鼠皮下移植瘤模子，证实4株过表达细胞及比照细胞对于在尾静脉过继NY-ESO-1 CAR-T细胞的相应性差异。经由过程Caspase-8活性检测、流式检测、CHIP-seq及RNA-seq等要领，证实MCL1以及JUNB基因经由过程影响线粒体凋亡旌旗灯号通路去抵挡FasL以及TRAIL引诱的细胞灭亡。经由过程细胞因子排泄检测及COIP等试验证实B3GNT2基因重要经由过程影响肿瘤细胞与T细胞的受体配体联合阐扬免疫耐受功效。构建4个差异基因敲低肿瘤细胞株，反向验证是否有免疫增敏效果。同时用小份子按捺剂证实基因准确性。

2 研究内容

作者经由过程起首制备CRISPR-Cas9激活文库，然后构建NY-ESO-1抗原高表达的文库细胞株，继而与NY-ESO-1的CAR-T细胞举行共造就，经由过程瞬时杀伤以及长效杀伤的两种筛选体式格局举行筛选，将筛选后的样本经由过程CRISPR-Screen举行差异基因开端筛选。于筛选好的差异基因与大众数据库中的数据举行比对于后，确定较着差异表达的CD27四、MCL一、JUNB、B3GNT2 4个基因举行后续研究。

TIP1：好的最先是乐成的一半啊，集美们，必然要用新奇的技能，联合已经有的大众数据库数据举行结合的基因掘客事情啊。

基在表达NY-ESO-1抗原的人玄色素瘤细胞A375构建CD27四、MCL一、JUNB、B3GNT2基因过表达肿瘤细胞，于体外与NY-ESO-1 CAR-T细胞共造就，后用CTG法检测各个过表达细胞株与比照细胞株的存活细胞之差，证实4个基因过表达后会降低CAR-T细胞的杀伤活气。

步调2中的过表达以及比照构建NGS小鼠，皮下肿瘤模子，成瘤后尾静脉过继CAR-T细胞，试验证实，过表达肿瘤对于CAR-T细胞的医治相应性更差，小鼠保存期更短。

已经有研究注解，JUNB是一种转录因子，而且可以或许影响NKG2D配体，从而影响NK细胞的一般杀伤功效，而MCL1更是于初期的研究中就发明与FASL以及TRAIL受体功效相干，是以作者也受其思绪开导，从受体方面入手验证。过表达以及比照用流式检测FASL以及TRAIL受体的表达量，确定过表达JUNB以及MCL1后，会影响受体表达；JUNB以及MCL1过表达细胞用 FasL 或者TRAIL处置惩罚后，检测Caspase-8的活性，发明JUNB的作用会被旋转，是以也确认JUNB是通路下流很是主要的一环；随后经由过程CHIP-seq以及RNA-seq两种技能，证实JUNB间接调控的基因是NFKB，而且可以或许经由过程操控NFKB来影响下流旌旗灯号通路的转导，至此，完善注释了JUNB基因影响免疫耐受的环路，而MCL1其实不影响前真个受体表达，是以作者证实它是间接调控了线粒体凋亡相干的BAX以及BAK阐扬功效。

TIP2：再次证实，多读文章有多主要啊集美们，请勿光是每天买买买，必然要看文献啊，当咱们的试验有了体系的理论根蒂根基以及撑持，才有了攀缘高分文章阶梯的爬山杖。

至在B3GNT2基因，今朝已经知它可以编码 -1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 ，是以作者合理猜度此基因影响多聚乳糖胺合成，而且今朝已经经有其他研究成果隐隐指了然这一证据。作者于增补试验中已经经经由过程番茄凝固素检测试验证明B3GNT2过表达细胞胞内以及胞外中多聚乳糖胺含量都有所增长，而这一征象，是因为B3GNT2引诱的N-糖基化润色以及O-糖基化润色有关。作者以此作为出发点，经由过程细胞因子排泄试验以及CTG细胞活气证实，于传统的共造就系统中，连续插手N-糖基化润色按捺剂KIF，可以或许旋转B3GNT2过表达带来的免疫耐受；经由过程COIP试验B3GNT2过表达以后番茄凝固素对于在各种肿瘤细胞外貌受体联合威力年夜幅晋升，这也撑持了作者的假说。

末了固然多项验证了，起首作者先于表达HER2抗原的SW1417细胞中敲低CD27四、MCL一、JUNB、B3GNT2 这4个基因，然后经由过程与HER2 CAR-T细胞共造就验证基因的有用性以及广泛性，后续于多种肿瘤细胞中证明N糖基化润色按捺剂KIF以及MCL1小份子按捺剂S63845的功效，从另外一角度证实了基因功效，而且为临床运用打开思绪。

TIP3：夸大一点，对于在肿瘤研究来讲，只管即便必然要回归临床，当咱们的研究有了必然的临床引导意思，咱们才好发文章啊。

综上所述，这篇文章体系的向咱们展示了，怎样用CRISPR-Cas9文库掘客差异基因及后续试验验证的全套历程。文章涵盖了文库筛选及肿瘤免疫两个范畴内研究热门，于选题方面可以说是羚羊挂角，不负高分期刊之名，值患上咱们深切进修以及参考。